【導讀】流式細胞術(shù)被臨床醫(yī)生和診斷醫(yī)生廣泛用于分析細胞特性。他們用光學方法逐一評估每個細胞的蛋白質(zhì)含量、血液健康狀況、粒度和細胞大小等屬性。盡管系統(tǒng)靈敏度高，但流式細胞儀的設(shè)計人員一直面臨著需要加速分析的壓力，這就要求采用新的方法設(shè)計流式細胞術(shù)及其相關(guān)電子元件。
本文將簡要介紹流式細胞術(shù)系統(tǒng)的工作原理。然后介紹 Analog Devices 的 18 位 ADC 模塊 ADAQ23878，并展示如何利用該模塊來設(shè)計流式細胞儀的檢測和轉(zhuǎn)換階段。此外，本文還將介紹一個可用于評估流式細胞術(shù)前端設(shè)計的評估套件。希望通過本文，讀者能夠更好地了解流式細胞術(shù)的高效數(shù)據(jù)采集解決方案。
流式細胞術(shù)被臨床醫(yī)生和診斷醫(yī)生廣泛用于分析細胞特性。他們用光學方法逐一評估每個細胞的蛋白質(zhì)含量、血液健康狀況、粒度和細胞大小等屬性。盡管系統(tǒng)靈敏度高，但流式細胞儀的設(shè)計人員一直面臨著需要加速分析的壓力，這就要求采用新的方法設(shè)計流式細胞術(shù)及其相關(guān)電子元件。
流式細胞儀對各個細胞進行激光照射，產(chǎn)生散射和熒光信號。為了快速、準確地捕捉所產(chǎn)生的光線并將其轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號，需要一個雪崩光電二極管 (APD) 和復雜的電子元件。要設(shè)計和實現(xiàn)這個過程的電路可能需要很長時間，特別是考慮到流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)需要高速、低噪音的設(shè)備來確保系統(tǒng)的準確性。
為了實現(xiàn)更快的流式細胞術(shù)分析并保證成本效益，設(shè)計人員可以通過由內(nèi)部放大器驅(qū)動器和模數(shù)轉(zhuǎn)換器 (ADC) 組成的數(shù)據(jù)采集解決方案解決速度和準確性問題。
現(xiàn)代流式細胞術(shù)原理
現(xiàn)代流式細胞術(shù)是一個自動化過程，可以分析細胞和表面分子，描述并定義異質(zhì)細胞群中的不同細胞類型。不算準備時間（可能超過一個小時），該儀器能在不到一分鐘的時間里對 10000 個單細胞進行三到六個特征評估。為了實現(xiàn)這一點，流式細胞術(shù)的單細胞制備步驟至關(guān)重要。樣品在鞘液中組織，以流體力學方式將細胞或顆粒聚焦到狹長的單細胞列樣品流中，以進行分析。在經(jīng)過這種轉(zhuǎn)換后，單細胞必須保持其自然的生物特征和生化成分。圖 1 是流式細胞術(shù)儀的示意圖，首先從頂部加入多細胞樣品。
圖 1：流式細胞儀示意圖，從鞘液聚焦到數(shù)據(jù)采集。（圖片來源：Wikipedia，由 Bonnie Baker 修改）
流式細胞儀包含六個主要組件：流通池、激光器、雪崩光電二極管 (APD)、跨阻放大器 (TIA)、ADC，以及用于數(shù)據(jù)收集和分析的計算機。流式細胞儀有液流或鞘液，這兩者會收窄，以將細胞排列成單列送過光束。激光每次捕獲一個細胞，產(chǎn)生前向角散射光 (FSC) 信號和側(cè)向角散射光 (SSC) 信號。熒光通過鏡子和過濾器進行分類，然后由 APD 進行放大。接下來，在產(chǎn)生的光輸出擊中 APD 后對其進行檢測、數(shù)字化和分析。對于檢測來說，Analog Devices 的 LTC6268 500 兆赫 (MHz) 超低偏置電流、低電壓噪聲 FET 輸入運算放大器對于檢測所需的高速 TIA 是理想選擇。
圖 2：TIA 電路使用一個 APD (PD1) 和一個低輸入電流的 FET 運算放大器，將超低的光電二極管電流轉(zhuǎn)換成 IN1+ 的輸出電壓。（圖片來源：Bonnie Baker）
設(shè)計此放大器電路時，必須盡可能地擴大帶寬，因而必須盡量減少寄生電容。例如，寄生反饋電容 C 影響了圖 2 的電路穩(wěn)定性和帶寬。無論選擇何種電阻器封裝，在放大器的反饋路徑中總會存在寄生電容。但是，0805 封裝端蓋間距較長，寄生電容最低，是高速應(yīng)用的首選。增加 R1 端蓋之間的距離并不是減少電容的唯一方法。另一種減少板對板電容的方法是在電阻 R1 下增設(shè)一條接地線，來屏蔽產(chǎn)生寄生電容的電場路徑（圖 3）。
圖 3：在反饋電阻下增設(shè)接地線，可從反饋端分流電場，并將傾泄至地面。（圖片來源：Analog Devices）
在這種情況下，該方法具體涉及到在靠近 TIA 輸出端的電阻墊下面和之間放置一條短的接地線。此方法可讓寄生電容達到 0.028皮法拉 (pF)，TIA 帶寬達到 1/(2π*RF*CPARASITIC)，相當于 11.4 MHz。光信號會導向幾個帶有適當濾光片的雪崩二極管。APD、TIA 和 ADC 系統(tǒng)將這些信號轉(zhuǎn)換為其數(shù)字表示，并將數(shù)據(jù)發(fā)送到微處理器做進一步分析。現(xiàn)代細胞儀通常配備多個激光器和 APD。目前的商用設(shè)備有 10 個激光器和 30 個雪崩光電二極管。增加激光和光電倍增管檢測器的數(shù)量，可以進行多次抗體標記，從而通過表型標記精確識別目標細胞群。
鞘液流速
流體力學聚焦過程形成單細胞列的能力
隧道直徑
保持細胞完整性的能力
流式細胞術(shù)聲波聚焦
雖然增加多個激光器和 APD 可以加速分析和識別，但在最好的情況下，最新的現(xiàn)代單細胞流式細胞術(shù)每分鐘可以收集多達一百萬個細胞的數(shù)據(jù)。在許多應(yīng)用中，如檢測血液中低至每毫升 100 個的循環(huán)腫瘤細胞時，這種處理遠遠不夠。在罕見細胞的臨床應(yīng)用中，試驗經(jīng)常需要對數(shù)十億的細胞進行分析，非常耗時。聲波聚焦過程是流體力學聚焦細胞制備過程的替代方案。在該過程中，將一種壓電材料（如鋯鈦酸鉛 (PZT)）附著在玻璃毛細管上，使電脈沖轉(zhuǎn)換成機械振動（圖 4a）。通過使用 PZT 在矩形流通池的共振頻率下振動玻璃毛細管的側(cè)壁，系統(tǒng)會產(chǎn)生具有不同數(shù)量壓力節(jié)點的各種聲駐波。
圖 4：矩形玻璃毛細管制成的聲學流通池示意圖 (a)。定寬毛細管的前三個壓力節(jié)點的位置 (b)。（圖片來源：美國國家生物技術(shù)信息中心）
這些 PZT 頻率節(jié)點將流動的粒子排列成多條離散的流線（圖 4b）。聲學流通池使用線性聲駐波，通過產(chǎn)生單次或多次諧波來調(diào)諧為各種波長。正如簡單線性駐波模型所預測的那樣，樣品中的細胞在流通池中產(chǎn)生單個或多個單細胞列。借助這種精確的細胞組織，鞘液隧道的寬度可以擴大，以加速流過激光束（圖 5）。
圖 5：對于流體力學樣品流（c.和 d.），隨著鞘液寬度增加，細胞樣品發(fā)生散射，使光學測量過程變得困難。無論鞘液寬度如何，聲波聚焦的樣品流（a.和 b.）都保持單列細胞。（圖片來源：Thermo Fischer Scientific）
傳統(tǒng)的流體力學聚焦（圖 5c.）將單細胞排成列，準備進行激光掃描。雖然樣品流核心的漏斗越寬，鞘液材料的速度就越快（圖 5d.），但這也會導致單細胞列發(fā)生分散，從而產(chǎn)生信號變化并影響數(shù)據(jù)質(zhì)量。聲波聚焦（圖5a.）將生物細胞和其他顆粒緊密地排列在一起，即使隧道較寬也沒有問題。這種精確的細胞排列允許更高的采樣率，同時保持數(shù)據(jù)質(zhì)量（圖 5b.）。在實踐中，流式細胞術(shù)聲波聚焦可使細胞采樣頻率提高約 20 倍（圖 6）。
圖 6：基于流體流式細胞術(shù)（A、B、C）與聲波聚焦細胞術(shù) (D) 對比的各種流式細胞術(shù)設(shè)備采樣時間比較。（圖片來源：Thermo Fischer Scientific）
在圖 6 中，A、B 和 C 的設(shè)備采用流體力學技術(shù)，而 D 則采用聲波聚焦流式細胞術(shù)方法。
聲波聚焦流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)采集
聲波聚焦流式細胞術(shù)設(shè)備的電子元件設(shè)計需要高速光敏電子元件，以適應(yīng)血液細胞和鞘液通過較大直徑噴嘴的速度。前面提到的 600 MHz 高速 LTC6268 與專門的 0805 電阻封裝布局相結(jié)合，使光感應(yīng)速率高達 11.4 MHz（圖 7 左）。LTC6268 的輸出被送入Analog Devices ADAQ23878 ADC 進行數(shù)字化。
圖 7：ADAQ23878 ADC 將光電二極管 (PD1) 和 TIA 電路（左）的光信號數(shù)字化。（圖片來源：Bonnie Baker）
ADAQ23878 是一款 18 位、每秒 15 兆次采樣 (MSPS) 的精密高速系統(tǒng)級封裝 (SIP) 數(shù)據(jù)采集解決方案。它將設(shè)計人員所面對的輸入驅(qū)動元器件選擇、優(yōu)化和布局等設(shè)計挑戰(zhàn)轉(zhuǎn)移至設(shè)備，從而極大地縮短了精密測量系統(tǒng)的開發(fā)周期。
這種 SIP 的模塊化方法通過將多個通用信號處理和調(diào)節(jié)模塊與高速、18 位、15 MSPS 逐次逼近寄存器 (SAR) ADC 組合在一個設(shè)備中，減少了終端系統(tǒng)的元器件數(shù)量。這些模塊包含一個低噪聲、全差分 ADC 激勵放大器和一個穩(wěn)定的參考緩沖器。
ADAQ23878 還集成了關(guān)鍵的無源元器件，它們采用 Analog Devices 的iPassive 技術(shù)，可最大限度地減少與溫度有關(guān)的誤差源并優(yōu)化性能。ADC 快速建立的驅(qū)動級有助于其確保快速數(shù)據(jù)采集。
為了評估 ADAQ23878，Analog Devices 提供了 EVAL-ADAQ23878FMCZ 評估板（圖 8）。該評估板可展示 ADAQ23878 μModule 的性能，是用于評估流式細胞術(shù)前端設(shè)計和其他各種應(yīng)用的一款多功能工具。
圖 8：用于 ADAQ23878 的 EVAL-ADAQ23878FMCZ 評估板板載電路，配備用于控制和數(shù)據(jù)分析的關(guān)聯(lián)軟件，并且兼容 SDP-H1。（圖片來源：Analog Devices）
EVAL-ADAQ23878FMCZ 評估板需要一臺運行 Windows 10 或更高版本的個人計算機、一個低噪聲的精密信號源以及一個適合 18位測試的帶通濾波器。該評估板需要 ADAQ23878 ACE 插件和 SPD-H1 驅(qū)動器。
雖然使用標準的流體力學聚焦流式細胞術(shù)逐一檢查生物細胞已取得成功，但由于需要加快分析速度，人們開始轉(zhuǎn)而改用以聲波聚焦流式為主的方法。因此，若要支持更先進的流式細胞術(shù)，電子元件也必須改進，同時盡量縮小空間、節(jié)約成本并縮短開發(fā)時間。如本文所述，LTC6268 高速運算放大器可與 ADAQ233878 精密、高速、μModule 數(shù)據(jù)采集解決方案相結(jié)合，為先進的流式細胞術(shù)設(shè)備建立完整的數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)，從而保證快速的數(shù)據(jù)采集。
(作者：Bonnie Baker，來源：DigiKey得捷）
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